Люис РПГА тест набор реагентов для определения антител к Treponema pallidum в сыворотке крови человека при диагностике сифилиса инструкция, аналоги и состав

1. ПРИЗНАЧЕННЯ

Набір реагентів «Люїс РПГА тест», далі по тексту - Набір, призначений для застосування в клініко-діагностичних лабораторіях лікувально-профілактичних установ при обстеженні з метою діагностики сифілісу.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРУ

2.1. Принцип дії

При взаємодії специфічних антитіл, які знаходяться в сироватці (або плазмі) крові людини, з діагностикумом, що містить антигени Treponema pallidum, відбувається аглютинація еритроцитів діагностикума.

2.2. Склад набору

Інгредієнт	Кількість	Опис
Діагностикум	8,5 мл (1 флакон-10мл) в прозорому фл. з пластмасовою кришечкою червоного кольору.	Суспензія формалінізованих еритроцитів курчати, сенсибілізованих антигеном Treponema pallidum. Суспензія червоно-коричневого кольору, при зберіганні розділяється на 2 фракції: верхню - прозору світло-жовту рідину, нижню - темно-бурий осад еритроцитів. Містить консервант - азид натрію в концентрації 0,1%.
Контрольні еритроцити	8,5 мл (1 флакон-10мл) в прозорому фл. з пластмасовою кришечкою білого кольору.	Формалінізовані еритроцити курчати, не сенсибілізовані антигеном Treponema pallidum. Суспензія червоно-коричневого кольору, при зберіганні розділяється на 2 фракції: верхню - прозору світло-жовту рідину, нижню - темно-бурий осад еритроцитів. Містить консервант -азид натрію в концентрації 0,1 %.
Позитивний контрольний зразок (К+)	0,5 мл (1 флакон- 3 мл) в флаконі з кришеч- кою черво- ного кольору	Сироватка (або плазма) крові людини із клінічно й серологічно підтвердженим діагнозом сифілісу, що містить антитіла до антигенів Treponema pallidum, і не містить антитіл до ВІЛ-1,2, вірусу гепатиту С, а також НВsАg. Містить консервант - азид натрію в концентрації 0,1 %. У РПГА з діагностикумом демонструє наявність антитіл у титрі не менш 1:1280. Прозора рідина жовтуватого кольору.
Негативний контрольний зразок (К-)	0,5 мл (1 флакон- 3 мл) в флаконі з кришеч- кою білого кольору	Сироватка (або плазма) здорової людини, яка не містить антитіл до антигенів Treponema pallidum, ВІЛ-1,2 і вірусу гепатиту С, а також НВsАg. Містить консервант - азид натрію в концентрації 0,1 %. У РПГА з діагностикумом показує відсутність антитіл до антигенів Treponema pallidum. Прозора рідина жовтуватого кольору.
Буфер для розведення	20 мл (1 флакон- 20 мл) в флаконі з кришеч-кою білого кольору	Прозора рідина жовто-жовтогарячого кольору в скляному флаконі об’ємом 20 мл. Містить консервант - азид натрію в концентрації 0,1 %.
Планшет для мікро-титрування	2 шт.	Планшет гемаглютинаційний нерозбірний з U-подібними лунками, у поліетиленовому пакеті із замком.

3. ЗАСТЕРЕЖНІ ЗАХОДИ

При роботі зі зразками сироваток (або плазмою) крові пацієнтів слід поводитися як з потенційно інфекційними об'єктами, дотримуючись застережних заходів (СП 3.3.2.1288-03).
Не дозволяється модифікувати процедуру проведення аналізу, скорочувати тривалість часу постановки реакції, використовувати реагенти інших виробників, а також реагенти інших серій набору «Люїс РПГА».
Необхідно передбачити заходи щодо запобігання перехресній контамінації реагентів.
Компоненти «Люїс РПГА тесту» містять 0,1% азиду натрію як консервант, який може бути токсичний при потраплянні всередину.

4. ОБЛАДНАННЯ Й МАТЕРІАЛИ, НЕОБХІДНІ ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

Дозатори механічні зі змінними наконечниками, з діапазоном дозування рідини 10 -100 мкл, 100-1000 мкл.
Таймер.
Холодильник.
Рукавички латексні.

ЗРАЗКИ ДЛЯ АНАЛІЗУ

Для дослідження використовують сироватку (або плазму) крові людини.

Для одержання сироватки свіжовзяту кров, отриману від пацієнта, інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 30-60 хв, витримують при температурі 4 °С протягом 1,5 год, після чого центрифугують протягом 10 хв зі швидкістю 1,5 тис. об/хв. Не використовують зразки зі слідами бактеріального проросту, гемолізовані або хільозні.

Допускається зберігання сироваток при температурі від 2 до 8 °С протягом 5 днів або при мінус 20 °С не більше 6 тижнів.

6.ПРОВЕДЕННЯ АНАЛІЗУ

6.1. Підготовка реагентів

Всі реагенти й зразки до початку дослідження витримують протягом 30 хв при температурі від 18 до 25 °С.

Перед використанням діагностикум і контрольні еритроцити (флакон 1 і флакон 2) струшують до утворення гомогенної суспензії. Не допускається підсихання діагностикума й контрольних еритроцитів на стінках флаконів у процесі зберігання набору.

Для постановки реакції застосовують планшети для мікротитрування з V-подібними лунками.

Примітка: Реакцію проводять лише на горизонтальній поверхні, не допускаючи близькості приладів, що створюють вібрацію.

6.2. Проведення аналізу

УВАГА: реакцію з К+ і К- ставлять так само, як і з досліджуваним зразком сироватки крові.

Якісний метод

1) Розведення випробуваної сироватки готовлять безпосередньо в лунках планшета для мікротитрування. Для цього в лунки вносять буфер для розведення (флакон 5) за такою схемою:

Ряд 1 (вертикальний) 25 мкл

Ряд 2 (вертикальний)100 мкл

Ряди 3 і 4 (вертикальні)25 мкл

Вносять 25 мкл сироватки, яка буде досліджуватися, в лунку ряду 1 (одержують розведення сироватки 1:2). Перемішують вміст лунки ряду 1 і переносять 25 мкл у лунку ряду 2 (одержують розведення сироватки 1:10). Перемішують вміст лунки ряду 2 і переносять по 25 мкл у лунку ряду 3 і в лунку ряду 4, перемішують і видаляють по 25 мкл; лунки рядів 3 і 4, що містять по 25 мкл розведення 1:20 досліджуваної сироватки, використовують для постановки реакції.

Розведення сироватки 1:20 можна приготувати в лунці ряду 1. Для цього до 190 мкл буфера для розведення (флакон 5) додають 10 мкл сироватки, перемішують, після чого із цієї лунки відбирають по 25 мкл і переносять у лунки рядів 2 і 3. У цьому випадку для постановки реакції використовують лунки 2 і 3 рядів, що містять по 25 мкл розведення досліджуваної сироватки 1:20.

Розведення вихідних сироваток 1:20 допускається робити в мікропробірках, наприклад, додати 10 мкл сироватки до 190 мкл буфера для розведення (флакон 5) і перемішати. Для постановки реакції у дві лунки планшета для мікротитрування вносять по 25 мкл приготовленого розведення досліджуваної сироватки.

2) Додають по 75 мкл суспензії діагностикума (флакон 1) у лунки 4-го ряду й по 75 мкл суспензії контрольних еритроцитів (флакон 2) у лунки 3-го ряду. Кінцеве розведення досліджуваної сироватки становить 1:80. Необхідно підтримувати збереження однорідності суспензій у флаконах, із яких здійснюється розкапування. При утворенні осаду або розшаровуванні, яке намічається, ретельно перемішують вміст флакона.

3) У кожну постановку обов'язково включають позитивний контроль (К+) (флакон 3) і негативний контроль (К-) (флакон 4), що входять до складу набору. Реакцію з контрольними зразками ставлять аналогічно.

4) Після розкапування реагентів обережно погойдують планшет (протягом 1 хв) вручну, щоб перемішати вміст лунок. Закривають планшет й інкубують його 45-60 хв при кімнатній температурі. До обліку результатів планшет повинен бути нерухомим! Планшет можна залишити на ніч.

5) Враховують результати аглютинації.

Кількісний метод

Після визначення антитіл у зразку сироватки (або плазмі) крові якісним методом на наступному етапі може бути проведений кількісний аналіз позитивних зразків. Початкове розведення сироватки для кількісного визначення - 1:80. Схема постановки реакції така:

1) Вносять по 25 мкл буфера для розведення (флакон 5) у лунки вертикальних рядів 1-8 (кількість горизонтальних рядів повинна відповідати кількості зразків) планшета для кількісного аналізу.

2) Вносять по 25 мкл буфера для розведення (флакон 5) у лунки вертикальних рядів 1-8 для титрування позитивного контролю (К+) (флакон 3).

3) Вносять по 25 мкл буфера для розведення (флакон 3) у дві лунки планшета для постановки реакції з негативним контролем (К-) (флакон 4).

4)Вносять по 25 мкл зразка з відповідної лунки ряду 2 (розведення сироватки 1:10) планшета, який був використаний для постановки якісного методу, у лунку вертикального ряду 1 і 2 планшета, який використовувався для кількісного методу, перемішують вміст лунок. Із лунки 1 видаляють 25 мкл.

5) Із лунки вертикального ряду 2 після перемішування вмісту переносять 25 мкл у лунку 3. Готують послідовні дворазові розведення зразка в лунках рядів 3-8 (розведення зразків сироватки від 1:20 до 1:1280). Із останньої лунки (ряд 8) відбирають надлишкові 25 мкл і видаляють.

6) Для постановки реакції з негативним контролем у дві лунки, що містять по 25 мкл буфера для розведення (див. п. 1), додають по 25 мкл розведення К- 1:10, перемішують і видаляють по 25 мкл.

7) Вносять по 75 мкл контрольних еритроцитів (флакон 2) у лунки вертикального ряду 1 і в одну з лунок з К- (кінцеве розведення досліджуваної сироватки - 1:80).

8)Вносять по 75 мкл діагностикума (флакон 1) у лунки рядів 2-8, а також у другу лунку з негативним контролем. Кінцеві розведення досліджуваних зразків сироватки (або плазми) крові й К+ від 1:80 до 1:5120.

9)Перемішують вміст лунок планшета обережним погойдуванням протягом 1 хв вручну. Закривають кришкою й залишають на 45-60 хв при температурі від 18 до 25 °С. До обліку результатів планшет повинен бути нерухомим! Планшет можна залишити на ніч.

10)Враховують результати реакції.

7. РЕЄСТРАЦІЯ Й ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

7.1. Загальні відомості при обліку результатів.

1) Облік результатів здійснюють візуально за такою шкалою:

4+ - рівний шар аглютинованих еритроцитів по всій поверхні дна лунки («парасолька»), іноді зі складчастим краєм;

3+ - те саме, що й 4+, але з наміченим кільцем по периферії «парасольки»;

2+ - еритроцити утворюють широке кільце з вираженим просвітом в центрі;

1+ - еритроцити утворюють більш щільне кільце меншого розміру з невеликим просвітом у центрі;

± - компактний осад еритроцитів зі слабко помітним просвітом в центрі;

- - компактний осад еритроцитів у центрі лунки («ґудзичок»).

Примітка:

1) Слід звертати увагу на можливий нестандартний вид реакції. Загнуті або нерівні краї «парасольки» можуть бути результатом надлишку антитіл (ефект «прозони»).

2) У лунках з позитивним і негативним контролем, а також у лунках з досліджуваними зразками, при додаванні контрольних еритроцитів аглютинація повинна бути відсутня.

3) У лунках з негативним контролем і діагностикумом аглютинація повинна бути відсутня.

4) Аглютинація еритроцитів діагностикума за відсутності аглютинації контрольних еритроцитів свідчить про наявність у сироватці крові специфічних антитіл до Treponema pallidum. Зчитування результатів і їхню інтерпретацію здійснюють у порівнянні з контролями.

5) Аглютинація контрольних еритроцитів і аглютинація діагностикума при тестуванні проби свідчать про наявність антиеритроцитарних антитіл. У цьому випадку тест повторюють. Якщо при повторній постановці реакції з цією пробою знову спостерігають аглютинацію не лише діагностикума, але й контрольних еритроцитів, то тест проводять після абсорбції досліджуваної сироватки. Для цього до 10 мкл вихідної досліджуваної сироватки додають 190 мкл контрольних еритроцитів (флакон 2), перемішують й інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Центрифугують 3 хв при 2000 об/хв. Супернатант (розведення сироватки 1:20) використовують для постановки реакції із суспензією діагностикума й контрольних еритроцитів за стандартним протоколом (25 мкл супернатанта змішують із 75 мкл діагностикума, а 25 мкл супернатанта - з 75 мкл контрольних еритроцитів).

7.2. Інтерпретація результатів при якісному методі.

ПОЗИТИВНИМИ вважаються зразки, що реагують на 4+ і 3+;

СЛАБОПОЗИТИВНИМИ вважаються зразки, що реагують на 2+;

СУМНІВНИМИ вважаються зразки, що реагують на 1+;

НЕГАТИВНИМИ вважаються зразки, що реагують на ± і -.

При постановці реакції якісним методом у разі отримання слабопозитивних і/або сумнівних результатів рекомендується протестувати зразок повторно. При одержанні аналогічного результату рекомендується через деякий час повторне взяття крові й проведення повторного аналізу.

Примітка: Всі проби, що дають слабопозитивні й сумнівні результати, рекомендується додатково досліджувати іншими методами.

7.3. Інтерпретація результатів при кількісному методі.

При кількісному методі постановки реакції титром позитивної сироватки вважається максимальне розведення, яке дає результат «1+». При кількісному методі в позитивному контролі (К+) (флакон 3) повинні визначатися антитіла до Treponema pallidum у титрі не нижче 1: 1280.

8. УМОВИ ЗБЕРІГАННЯ ТА ЕКСПЛУАТАЦІЇ НАБОРУ

Зберігання відповідно до СП 3.3.2.1248-03 при температурі від 2 до 8 °С у недоступному для дітей місці. ЗБЕРІГАТИ ТІЛЬКИ ВЕРТИКАЛЬНО.

Транспортування відповідно до СП 3.3.2.1248-03 при температурі від 2 до 8 °С в умовах, що виключають заморожування. Допускається короткочасне (не більше 3 діб) транспортування при температурі від 9 до 25 °С.

Термін придатності - 18 місяців. Препарат з терміном придатності, що закінчився, застосуванню не підлягає.