ПЦР-детектив или видимый «букет непонятных проявлений»

ПЦР-детектив или видимый «букет непонятных проявлений»

ПЦР или полимеразная цепная реакция – это единственный на сегодня метод ДНК-диагностики. Метод ПЦР разработал еще в 1983 году Кэри Мюллис, за что уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. ПЦР позволяет быстро определять маркеры возбудителей инфекционных заболеваний (генетический материал – ДНК, РНК). По сравнению с традиционными методами диагностики, ПЦР отличается высокой чувствительностью и позволяет использовать для диагностики образцы, в которых уже нет живых возбудителей, а есть только оставшиеся фрагменты их генетического материала

Что такое ПЦР?

ПЦР или полимеразная цепная реакция – это единственный на сегодня метод ДНК-диагностики. Иначе говоря, ПЦР - это «сыскной орган» в «криминогенной ситуации» по имени Болезнь. ПЦР путем накопления (амплификации) фактов и улик (уникальный участок ДНК) составляет косвенное доказательство предполагаемого «преступника» (возбудителя заболевания). Это обстоятельство только в совокупности с цепью умозаключений (знаний врача) и логикой клинических проявлений (симптомов и жалоб), определяет болезнь.

Метод ПЦР разработал еще в 1983 году Кэри Мюллис, за что уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. С каждым годом на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики. Сегодня существует усовершенствованный метод ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), который лишен целого ряда недостатков своих предшественников, что значительно повышает его точность.

Назначение ПЦР - качественный и количественный анализ содержания ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) в биологических средах и субстратах. Качественная ПЦР (Polymerase chain reaction - PCR, в англоязычном варианте) применяется тогда, когда достаточно только выявить наличие фрагментов ДНК, а количественная (Real-Time PCR) - если необходимо получить информацию о вирусной нагрузке (количестве вируса), адекватности назначенного лечения или его результативности, о риске обострения заболевания.

Что можно выявить с помощью ПЦР?

ПЦР позволяет быстро определять маркеры возбудителей инфекционных заболеваний (генетический материал – ДНК, РНК). По сравнению с традиционными методами диагностики, ПЦР отличается высокой чувствительностью и позволяет использовать для диагностики образцы, в которых уже нет живых возбудителей, а есть только оставшиеся фрагменты их генетического материала.

Как работает ПЦР?

  • Принцип ПЦР впервые был описан в 1986 г. и заключался в обнаружении уникального участка ДНК, свойственного конкретному микроорганизму, и в «строительстве» новых ДНК или РНК возбудителей инфекций.
  • В основу метода ПЦР положено многократное копирование (амплификация) искомого фрагмента ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы (Taq - полимеразы).
  • Суть метода ПЦР. Проведение ПЦР-анализа в лаборатории происходит в три этапа: выделение ДНК, амплификация ДНК-фрагментов (размножение), детекция (узнавание) ДНК-продуктов амплификации. Один цикл ПЦР длится около трех минут. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей ДНК в следующем цикле амплификации, что и представляет собой цепную реакцию в ПЦР. В результате количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии. В течение 30 - 40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное не только для компьютерного, но и для визуального учета результатов. Для каждого возбудителя разработаны свои специфические генетические детекторы - эталонные фрагменты ДНК (праймеры), которые при попадании в исследуемый материал, подобно генетическим детективам, «прочесывают» раствор в поисках участка, которому они комплиментарны.

Преимущества

При ПЦР-диагностике размножению подвергается не бактерия или вирус, а только ее ДНК (или РНК), причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя. То есть, метод ПЦР обладает высочайшей чувствительностью, ведь для выявления конкретного микроорганизма (детекции) достаточно иметь всего лишь «осколки» его ДНК. Поэтому возможным становится обнаружение возбудителей заболеваний даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно.

Достоинства

  • Высокая специфичность позволяет определять уникальную последовательность нуклеотидов, характерную только для конкретного возбудителя.
  • Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.
  • ПЦР позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей и без какого-либо ущерба для качества результата.
  • Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаруживать возбудителя заболевания еще до появления признаков болезни в так называемом инкубационном периоде.

Недостатки

ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что в помещении должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью 99,9 %, так как в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен из окружающей среды – возможно «ложное срабатывание».

Показания к ПЦР-диагностике:

  • отрицательные результаты диагностики иными методами (иммунологический, бактериологический, микроскопический);
  • использование для диагностики образцов, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни;
  • замещение дорогостоящих иммунологических методов;
  • выявление широкого спектра заболеваний передающихся половым путем.

Когда следует бежать в лабораторию, чтобы сделать ПЦР?

Обязательно обратитесь к доктору или, как минимум, пройдите обследование в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений (цвет, количество, консистенция), случайный половой контакт без применения презерватива. Обратите внимание на себя также при длительной невысокой температуре тела (выше 37 °С в течение 1-го и более мес.); при длительном (более 2-х мес.) кашле, общем недомогании, «беспричинной» диарее, увеличении периферических лимфоузлов, при упорной головной боли, когда везде и все болит и т.п.

Есть ли противопоказания к ПЦР-диагностике?

Прямых противопоказаний не существует.

Что необходимо для получения достоверного результата?

Наряду с тем, что ПЦР способна выявлять малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца, в ряде биологических жидкостей возможно присутствие ингибиторов ПЦР (например, гемоглобин). Поэтому только высокое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования, контроль и перепроверка позволяют получить достоверный результат.

Информативность ПЦР-анализа зависит от многих обстоятельств. К ложноотрицательному результату может привести неправильная транспортировка и хранение полученных проб, приводящие к разрушению ДНК возбудителя инфекции. Ложноположительный результат анализа может быть получен в результате попадания в материал (мазок или соскоб уретры) крови, нарушения стерильности и режимных моментов исследования (чужеродные бактерии с рук врача, одежды, со стекла или загрязненных инструментов, многоразовой посуды). В результате обнаружится «несуществующая» инфекция. Неоснащенная и несовременная лаборатория с непригодными реагентами - это еще одна из серьезных причин недостоверной диагностики.

Как оценивать результат?

Качественная ПЦР обычно дает положительный (возбудитель есть) или отрицательный результат (возбудителя нет). Однако оценивать результаты ПЦР должен врач, который лечит больного, так как не всегда положительный ответ ПЦР означает наличие заболевания. ПЦР выявляет не саму болезнь, а лишь генный материал возможного возбудителя этой болезни.

Положительной ПЦР может быть и у больного, и у вылеченного здорового человека. У больного человека реакция даст положительный результат за счет генного материала неповрежденного возбудителя болезни. В то время как у вылеченного человека возможен положительный результат за счет следовых концентраций неповрежденного патогена и фрагментов его распавшейся на части ДНК или РНК.

Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии явной картины заболевания, возникает, как правило, когда материал для исследования берут неправильно или «не оттуда». Забор материала должен осуществляться в строгом соответствии с инструкциями лаборатории.

Что и как можно исследовать с помощью ПЦР:

  • забор крови желательно проводить натощак <; накануне следует избегать приёма жирной пищи;
  • соскоб из уретры рекомендуется сдавать через 2 часа после последнего мочеиспускания и не менее одних суток полового воздержания; из зева и носоглотки – натощак (через 3 – 4 часа после последнего приема пищи);
  • перед взятием секрета предстательной железы для ПЦР-диагностики рекомендуется половое воздержание в течение 2 дней;
  • мочу (первая порция утренней мочи), сперму, мокроту (после санации ротовой полости), слюну (натощак), кал и грудное молоко вы можете собрать самостоятельно в специальную стеклянную или пластиковую посуду;
  • забор синовиальной, спинномозговой, плевральной или амниотической жидкости, бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ), или забор материала путем биопсии осуществляется только врачом в условиях стационара (в лаборатории эти процедуры не проводятся) в одноразовую стерильную пробирку с транспортной средой.

Емкости: (стеклянная или пластиковая посуда, контейнер, пробирка и др.) для забора биологического материала можно получить в лаборатории.

Срок доставки материала в лабораторию не должен превышать при комнатной температуре более 6 часов, при температуре 2 – 8 °С – более 1 суток.

Существует ли методы диагностики со 100% точностью?

ПЦР-исследование относится к разряду самых точных диагностических методов определения генетических маркеров микроорганизмов у человека. Достоверность таких исследований достигает 95 - 99 %. Однако в любой области медицины не существует абсолютных гарантий и даже самое точное и хорошее исследование может дать сбой, встретившись с индивидуальными особенностями человеческого организма. В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом, а после определения возбудителя с помощью ПЦР, необходимо оценить и иммунный ответ в реакциях серологического тестирования. Поэтому положительный ответ лабораторного исследования – это повод не для паники, а для визита к врачу, который может при необходимости назначить вам ИФА – диагностику или некоторые из методов инструментальных исследований.